大鼠来源滑膜间充质干细胞的成软骨分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.15.008

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (15): 2338-2344.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.15.008

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大鼠来源滑膜间充质干细胞的成软骨分化

邵博，龚忠诚，刘慧，凌彬，克热木•阿巴斯，尹小朋，胡露露，王冰，宁晓婷，杨萌，林兆全

新疆医科大学第一附属医院颌面肿瘤外科，新疆医科大学口腔医学院，新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

出版日期:2014-04-09 发布日期:2014-04-09
通讯作者: 龚忠诚，博士，副主任医师，新疆医科大学第一附属医院颌面肿瘤外科，新疆医科大学口腔医学院，新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:邵博，男，1986年生，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市人，汉族，新疆医科大学在读硕士，主要从事颞下颌关节基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(31260229)，项目名称：PLLA/PDLA三维支架与滑膜间充质干细胞/软骨细胞构建颞下颌关节盘的研究

Chondrogenic differentiation of rat synovial-derived mesenchymal stem cells

Shao Bo, Gong Zhong-cheng, Liu Hui, Ling Bin, Keremu Abass, Yin Xiao-peng, Hu Lu-lu, Wang Bing, Ning Xiao-ting, Yang Meng, Lin Zhao-quan

Department of Oral & Maxillofacial Oncology Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Stomatology College of Xinjiang Medical University, Stomatology Research Institute of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Online:2014-04-09 Published:2014-04-09
Contact: Gong Zhong-cheng, Department of Oral & Maxillofacial Oncology Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Stomatology College of Xinjiang Medical University, Stomatology Research Institute of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Shao Bo, Studying for master’s degree, Department of Oral & Maxillofacial Oncology Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Stomatology College of Xinjiang Medical University, Stomatology Research Institute of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31260229

摘要/Abstract

摘要：

背景：相比其他组织来源的间充质干细胞，滑膜间充质干细胞有着较强的成软骨特性和克隆能力，因此将是软骨组织工程中最有前景的种子细胞之一。
目的：培养及体外扩增SD大鼠滑膜间充质干细胞，鉴定其多向分化潜能及在添加生长因子后三维立体培养条件下的成软骨能力。
方法：无菌条件下获取SD大鼠滑膜组织，Ⅰ型胶原酶消化法分离大鼠滑膜间充质干细胞。体外扩增、培养，取第3代滑膜间充质干细胞进行吉姆萨、生长曲线测定、成脂诱导、成骨诱导和三维条件下成软骨诱导，成软骨诱导21 d后通过甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色及RT-PCR对成软骨诱导后产物进行检测。
结果与结论：获取的大鼠滑膜细胞具有间充质干细胞的特性，滑膜间充质干细胞在体外培养呈成纤维样形态，并维持着多向分化的能力。使用生长因子诱导软骨细胞21 d后，可见软骨样组织，蛋白聚糖和Ⅱ型胶原可以在甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色后被检测到。RT-PCR检测结果显示软骨诱导分化后细胞中Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA呈阳性表达。提示大鼠来源的滑膜间充质干细胞具有成软骨能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 干细胞, 分化, 滑膜间充质干细胞, 成骨, 成脂, 成软骨, 生长因子, 三维培养, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Compared with other sources of mesenchymal stem cells, synovial-derived mesenchymal stem cells have significant characteristics of chondrogenesis and cloning. Therefore, synovial-derived mesenchymal stem cells are one of the most promising seed cells in cartilage tissue engineering.
OBJECTIVE: To isolate and culture synovial-derived mesenchymal stem cells of Sprague-Dawley rats, identify the multipotential differentiation and the potential ability of chondrogenic differentiation in three-dimensional culture condition.
METHODS: The synovium tissue was harvested from Sprague-Dawley rats. The synovial-derived mesenchymal stem cells were isolated with type Ⅰ collagen enzyme digestion method and cultured in vitro. The passage 3 cells were detected with giemsa staining, the cell cycle, adipogenic and osteogenic differentiation were determined. The passage 3 cells were centrifuged as pellets and cultured in the chondriogenic medium for 21 days. And the pellets were examined by toluidine blue staining, type Ⅱ collagen immunohistochemical staining and RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: The mesenchymal stem cells isolated from the synovium tissue of rats have the characteristics of mesenchymal stem cells, and exhibit fibroblast-like morphology after cultured in vitro. The multilineage differentiation potentials were also revealed. After the cell were cultured in chondrogenic medium for 21 days, chondroid tissue was found, type II collagen and aggrecan could be detected positively by toluidine blue staining, type Ⅱ collagen immunohistochemical staining, and expressed by RT-PCR examination. Therefore, synovial mesenchymal stem cells have a chondrogenic differentiation potential.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, collagen type II, reverse transcriptase polymerase chain reaction

中图分类号:

R318

邵博，龚忠诚，刘慧，凌彬，克热木•阿巴斯，尹小朋，胡露露，王冰，宁晓婷，杨萌，林兆全. 大鼠来源滑膜间充质干细胞的成软骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(15): 2338-2344.

Shao Bo, Gong Zhong-cheng, Liu Hui, Ling Bin, Keremu Abass, Yin Xiao-peng, Hu Lu-lu, Wang Bing, Ning Xiao-ting, Yang Meng, Lin Zhao-quan. Chondrogenic differentiation of rat synovial-derived mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(15): 2338-2344.

图/表（结果） 4

2.1 细胞形态学观察结果 倒置显微镜下观察，原代滑膜间充质干细胞培养24 h，大部分贴壁，部分伸展生长。48 h首次换液，可见有少量细胞贴壁生长，胞体呈短小梭形外还存在较多形态多样的细胞，胞核呈卵圆形位于细胞中央。随培养时间延长，细胞渐渐得到纯化，形态多样的细胞已明显减少，细胞大多呈梭形，纺锤样，边缘光滑，集落逐渐增大，呈平行排列或漩涡状具有一定的方向性，与纤维细胞的形态学特征一致。原代细胞5-7 d可传代，传代后细胞呈梭形，形态大小较一致。

扩增3代之后，可得到形态一致的成纤维样滑膜间充质细胞(图1A，B)。

2.2 增殖曲线绘制 细胞增殖曲线呈现“S”形，接种3 d内细胞处于停滞期，3-5 d为对数增长期，6 d达到生长峰，至第8天细胞增殖速度变缓，进入平台期(图2)。

2.3 成脂诱导及鉴定结果 加入成脂诱导液后，成纤维-纺锤样细胞开始回缩，变为多角形态；诱导3 d后可见单个脂质空泡形成；7 d时单个脂质空泡融合、变大。油红O染色后可见细胞内脂着色后呈朱红色(图1C)。

2.4 成骨诱导及鉴定结果 加入成骨诱导液后，细胞增殖速度减缓，细胞形态由纺锤样成为立方形，约10 d形成大的结节样结构，第14天茜素红染色后可着色，说明有钙沉积。对照组未被染色(图1D)。

2.5 成软骨诱导形态学观察结果 成软骨诱导后细胞微团成乳白色球状，表面光滑无空洞，有一定的韧性(图3A)；正常组即常规培养的滑膜间充质干细胞，呈乳黄色，组织松散可见空洞，质地较软无韧性。

2.6 苏木精-伊红染色及甲苯胺蓝染色结果 成软骨细胞诱导后，细胞微团外形成球状，苏木精-伊红染色后细胞基质和细胞核染成蓝色，细胞胞浆呈紫红色，胞核呈褐紫色，可见成熟的软骨凹陷形成(图3B)。甲苯胺蓝染色后可见胞核深蓝色，细胞外基质蓝染(图3C)，对照组未染色。

2.7 免疫组化检测结果 成软骨细胞诱导后，Ⅱ型胶原免疫组织化学结果为阳性，可见胞浆被染成棕褐色的阳性细胞，并且可见成熟的软骨小凹。

说明成软骨诱导后，可表达软骨的特异性蛋白Ⅱ型胶原(图3D)。

2.8 RT-PCR检测结果 滑膜间充质干细胞成软骨诱导21 d后，软骨特异性基因-Ⅱ型胶原及蛋白多糖基因的相对表达都显著提高。在使用GAPDH内参进行相对定量分析后，结果显示Ⅱ型胶原及蛋白多糖的表达均高于对照组。说明在分子水平中成软骨诱导的滑膜间充质干细胞在基因水平表达软骨的特异性标记物，表达量明显高于对照组(图4)。

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引言

成熟的软骨有很低的自我修复能力，归因于其内在性质-缺乏神经分布和血管供应，并且软骨细胞紧密的包绕于胶原-蛋白多糖基质中,从而限制了软骨细胞的迁移和增殖。小的缺损可以通过软骨细胞移植恢复，大的缺损可以通过下层纤维软骨恢复^[1] 。已有研究表明，当软骨缺损大于2-4 mm时，软骨缺损修复能力将极其有限^[2] 。因此，血液中的软骨祖细胞不能到达损伤的区域用于软骨损伤的修复。
目前关节软骨缺损在临床中缺乏有效的治疗方法，因此需要一个有效的补救措施是至关重要的。再生医学与组织工程技术的出现与发展，为一个长期治疗修复关节软骨提供新的希望——可以修复或替换受损或退化纤维软骨的组织。
目前软骨再生和组织工程的途径包括：种子细胞、支架材料和生长因子。干细胞是一类未分化、具有多向分化潜能和自我更新能力的细胞，它是关节软骨再生的重要因素，也是关节软骨再生的细胞来源。干细胞主要分为两类：成体干细胞和多能干细胞。成体干细胞存在于不同的组织和器官^[3] 。间充质干细胞被定义为贴壁细胞、成纤维纺锤样细胞、多能干细胞，可以分化为骨、软骨和脂肪、神经、肌肉等组织。间充质干细胞可以来源不同的组织，如骨髓、脂肪、滑膜、骨膜等。胚胎干细胞具有全能性，能够分化为体内特定的组织与器官，但是由于伦理学上的限制，促使越来越多的学者转向研究成体干细胞。自2001年，来源于关节表面滑膜组织的间充质干细胞被分离^[4] ，越来越多的学者开始关注滑膜间充质干细胞，这是因为滑膜间充质干细胞有着较强的成软骨分化能力，并具有更强的集落形成和扩增能力^[5] ，并且相比骨髓和脂肪间充质干细胞，滑膜细胞有着较强的成软骨特性。Yoshimura通过对比不同组织来源的间充质干细胞发现，滑膜间充质干细胞克隆能力是骨髓间充质干细胞的100倍^[6] 。在组织学中，滑膜组织衬覆于关节腔内面，具有润滑、屏障、修复等功能，滑膜细胞分为两种类型，巨噬细胞样和成纤维细胞样。巨噬细胞样细胞主要的功能是参与先天性和获得性免疫。成纤维细胞样细胞主要是形成滑液和干细胞的主要来源^[7-9] ，巨噬细胞样细胞并不能像成纤维细胞样细胞快速增殖，在扩增3代之后能获得大量的成纤维细胞样细胞。已有相关研究证明，巨噬细胞样细胞分裂增殖较为缓慢，随着体外培养时间的延长，巨噬细胞样细胞的透明度降低, 细胞胞质内的黑颗粒明显增多, 细胞逐渐出现衰老、死亡的迹象，并且衰老细胞数目增加, 约10 d后巨噬细胞样细胞将完全失去活性^[10-11] 。因此本实验使用的是第3代滑膜间充质干细胞。
实验通过体外培养滑膜组织并分离、纯化，拟探讨大鼠滑膜来源间充质干细胞的培养条件，分析其是否具有干细胞特性以及成软骨方向的分化条件，以期为以滑膜间充质干细胞作为软骨组织再生或治疗的种子细胞提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：体外细胞学对比观察实验。

时间及地点：于2011年8月至2013年10月在新疆医科大学第一附属医院医学研究中心干细胞研究室完成。

材料：

实验动物：健康雄性SD大鼠，体质量180-220 g，由新疆医科大学实验动物中心提供，SPF级，生产许可证号：SCXK(新) 2003-001。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

实验方法：

滑膜间充质干细胞的分离和原代培养：取SD大鼠，腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg达到麻醉效果后，用体积分数75%乙醇严格消毒术区，于双侧膝关节关节腔取出滑膜组织，浸泡于含1 000 U/mL 链霉素和青霉素的双抗H-DMEM中，低温下转移(冰盒)，移入超净工作台。

使用含1 000 U/mL双抗无菌PBS冲洗滑膜组织3次，用眼科剪将其剪成约1 mm×1 mm大小的组织块。加入10倍体积的0.4%Ⅰ型胶原酶，于37 ℃，体积分数5%CO₂饱和湿度条件下进行4 h消化，待絮状物大部分消失后，100目铜网过滤，吸取滤过液，1 200 r/min离心5 min，弃上清液，无菌PBS洗涤3次，用含体积分数10%胎牛血清的H-DMEM高糖培养基(含200 mmol/L谷氨酰胺，100 μmol/L抗坏血酸，100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素)，以2×10⁵/cm²的细胞浓度接种于培养皿中，置37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱中培养。48 h后首次换液，此后每48 h换液1次。

待细胞达80%-90%融合时，去除培养皿中培养液，PBS清洗2次，洗去细胞代谢产物及凋亡细胞。用含EDTA的2.5 g/L胰蛋白酶(10 cm皿中加入2 mL)轻轻摇动后。37 ℃条件下消化1 min后，镜下观察，待胞质回缩，细胞间质增大后，加入体积分数10%胎牛血清的培养液终止消化，用吸管轻缓反复吹打直至贴壁细胞悬浮，1 000 r/min离心5 min后，弃去上清，加入PBS清洗2次。以1∶3进行传代培养并用于后续实验。

此时所得为第1代细胞。以后根据细胞生长情况换液、传代培养^[12-13]。

细胞增殖曲线：取第3代滑膜间充质干细胞和软骨向诱导后的细胞，消化法消化细胞后，调整细胞悬液浓度为2×10⁷L^-1接种于96孔板，每孔100 μL，设5组复孔，常规培养，每3 d换液1次。每孔滴加10 μL CCK8液。滴加后2 h后测量每孔吸光度(A)值，连续测量8 d，每天计数5孔细胞，取均值绘制细胞生长曲线。

滑膜来源的间充质干细胞成骨诱导及鉴定：取第3代滑膜来源的间充质干细胞，待细胞融合80%-90%，加入成骨诱导液(含体积分数10%胎牛血清的H-DMEM、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、0.1 μmol/L地塞米松，50 μmol/L抗坏血酸)，对照组常规培养，3 d换液。

诱导7 d后，茜素红染色，倒置显微镜下观察染色情况。

滑膜来源的间充质干细胞成脂诱导及鉴定：第3代滑膜来源的间充质干细胞，待细胞融合80%-90%，加入成脂诱导液(含体积分数10%胎牛血清的H-DMEM，0.5 mmol/L IBMX，200 μmol/L吲哚美辛，1 μmol/L地塞米松，10 μmol/L胰岛素)，对照组常规培养，隔日换液。

诱导7 d后，油红O染色，倒置显微镜下观察染色情况。

滑膜来源的间充质干细胞成软骨诱导及鉴定：取对数期第3代滑膜细胞，用PBS冲洗3次，每次5 min，用含EDTA的2.5 g/L胰蛋白酶消化后计数，将1×10⁶ L^-1 滑膜细胞的细胞悬液移入15 mL聚丙烯离心管内，1 200 r/min离心10 min，使细胞聚集于离心管底行pellet三维培养。然后弃去上清液，沿管壁滴加无血清DMEM培养液1 mL培养24 h。之后将实验组培养液更换为软骨诱导液(10 μg/L 转化生长因子β1、10^-7 mol/L地塞米松、100 μmol/L 2-磷酸抗坏血酸、200 mmol/L左旋谷氨酰胺、1% ITS+ Premix)。每3 d换液，21 d终止。

正常组为滑膜间充质干细胞做常规培养，不添加诱导剂。

阴性对照组为本课题组前期实验中培养的大鼠骨髓间充质干细胞，同样不添加诱导剂，进行常规培养。

分别进行甲苯胺蓝染色、苏木精-伊红染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色及RT-PCR检测(引物序列、退火温度及循环次数见表1)，分析细胞外基质及软骨特异性mRNA的表达。

主要观察指标：观察滑膜间充质干细胞形态，体外增殖能力，成骨、成脂诱导前后形态变化，成软骨诱导分化后甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组化染色情况及Ⅱ型胶原的mRNA表达变化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

软骨的破坏大多是由于先天性异常、退化性关节疾病和创伤性损伤，创伤是最常见的病因。在各个年龄段，关节软骨的破坏都会引起患者疼痛、神经衰弱和昂贵的医治费用，并且损伤后可能导致骨关节炎和类风湿性关节炎。成熟的软骨有很低自我修复能力，这是由于缺乏神经支配和血管供应，仅靠关节腔内滑液来获取营养。另一个重要原因是软骨细胞的有丝分裂潜力较低^[14-15] 。小的缺损可以通过软骨细胞移植恢复，较大的缺损可以通过下层纤维软骨恢复^[1] 。然而，在许多情况下需要对缺损进行外科手术。近年来，通过组织工程技术修复软骨组织，为软骨缺损的修复提供了一个新的思路。
干细胞作为关节软骨再生的种子细胞，对于关节软骨再生是一个关键因素，间充质干细胞来源于中胚层。干细胞大体上分成两类，第一类是成体干细胞，第二类是多能干细胞。成体干细胞存在于不同的组织和器官中，对于组织损伤时能显示出多能再生性[3]。间充质干细胞被定义为贴壁细胞、成纤维纺锤样细胞、多能干细胞，可以分化为骨、软骨和脂肪、神经、肌肉等组织。间充质干细胞可以来源不同的组织，如骨髓、脂肪、滑膜、骨膜等^[16-17] 。
在胚胎学中，滑膜来自于关节表面，属于间叶细胞。并且在生物力学、生物化学上支撑关节^[18-19] 。在组织学中，滑膜组织衬覆于关节腔内面，具有润滑、屏障、修复等功能，滑膜细胞分为两种类型，巨噬细胞样和成纤维细胞样。巨噬细胞样细胞主要的功能是参与先天性和获得性免疫。本实验获取的滑膜细胞在细胞形态上呈纺锤-成纤维样、贴壁细胞，形态单一符合间充质细胞形态学特征。并在添加成分诱导液诱导成骨、成脂、成软骨三向分化，并对其检测，验证了滑膜间充质干细胞具有多向分化的潜能。在实验过程中，作者发现滑膜间充质干细胞至少可以扩增8代，并同样具有多向分化的能力。
Sakaguchi等^[2]将滑膜间充质干细胞与骨膜间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和骨骼肌间充质干细胞进行了比较，证实滑膜间充质干细胞的成软骨能力明显强于其他组织来源的间充质干细胞，并且有着较低的成骨的潜能。Yoshimura等^[3]通过对比不同组织来源的间充质干细胞发现，滑膜间充质干细胞克隆能力是骨髓间充质干细胞的100倍。软骨细胞和滑膜间充质干细胞表达相同的基因-Ⅱ型胶原和蛋白聚糖。在生长发育过程中，滑膜细胞和关节软骨细胞发育来自相同的前提细胞，在成年前保持的密切的关系^[20-22] ，另外，滑膜细胞和软骨细胞能产生软骨低聚物基质蛋白、接蛋白和萄糖氨基聚糖，因为这些特性，滑膜间充质干细胞是软骨组织工程中最有前景的种子细胞。
间充质干细胞诱导软骨细胞分化的需要各种内在和外在因素，生长因子在这一过程中重要的角色。用于软骨组织工程的生长因子主要包括转化生长因子β家族、胰岛素样生长因子、骨形态发生蛋白、软骨形态发生蛋白等^[23-28] 。
间充质干细胞具有独特生物特征可以由许多因素影响，其中包括特定的生长因子的影响，这些信号分子可以间接通过膜受体和信号通路间接作用或直接通过转录控制。来源于转化生长因子β超家族的生长因子在软骨组织工程领域可能大多数活性物质已被研究。近期，超过20个成员拥有3个Ⅱ型受体和拥有3个Ⅰ型受体已经在脊柱动物中被揭露。在结构上它们与同二聚体和异源二聚体用一个二硫键联系在一起^[29] 。在细胞增殖、凋亡和分化过程中他们扮演着很重要的角色。而且，他们参与细胞周期的调控和免疫系统。
转化生长因子β1可以刺激软骨合成并且在体外能抑制白细胞介素1的代谢作用。实验研究证实在体外可以提高间充质细胞的增殖和成软骨分化。此外添加转化生长因子β1的间充质细胞会使Ⅰ型胶原基因下调，Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因上调^[30]。转化生长因子β3可以增加软骨外基质的生产。Thorpe等^[31]发现转化生长因子β可以增加硫酸糖胺聚糖的合成。转化生长因子β信号可以诱使细胞内信息传导促进软骨特异性基因的表达，包括SMAD蛋白、丝裂原活化蛋白激酶、P38、细胞外信号调节激酶1和c-Jun氨基末端激酶使得间充质干细胞增殖和形成软骨细胞^[32-34] 。因此认为转化生长因子β在软骨转化过程中起着关键作用^[35-44] 。已有研究证实，转化生长因子β1体外诱导间充质干细胞向软骨方向分化时在在10 ng/L浓度下作用最佳^[45] 。在一定浓度内，生长因子的作用具有浓度的依赖性，当超出依赖浓度范围成软骨方向分化的作用就不明显了。
近年来，胰岛素铁硒传递蛋白是胰岛素、转铁蛋白和硒的混合物，运用于软骨组织工程的研究中，他们可促使间充质干细胞向软骨分化，使软骨特异性的分子上调，例如Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、聚糖、二聚糖。地塞米松的使用可以抑制肥大细胞的产生，有助于维持软骨细胞表型。然而，单独使用转化生长因子β1可能不会使间充质细胞的分化成软骨细胞^[46] 。
因此本实验用成软骨诱导液包含生长因子β家族、ITS、糖皮质激素等成软骨细胞分化的重要成分。为了进一步证明诱导21 d后的滑膜间充质干细胞在体外向软骨分化，作者通过软骨特异性染色检测细胞外基质合成，发现了软骨外基质萄糖氨基聚糖的生成。在蛋白水平作者通过免疫组化检测到了Ⅱ型胶原的合成，同时RT-PCR技术也检测到了软骨特异基因的表达，因此在蛋白水平和基因水平的结果是一致的。
综上所述，滑膜间充质干细胞是一种获取方便、增殖迅速的种子细胞。滑膜间充质干细胞具有良好的软骨分化潜能，Pellet三维培养条件下使用转化生长因子β1、ITS联合诱导后可检测出软骨特异性的基因、蛋白和细胞外基质表达。因此，作者认为滑膜间充质干细胞是软骨组织工程较佳的种子细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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大鼠来源滑膜间充质干细胞的成软骨分化

Chondrogenic differentiation of rat synovial-derived mesenchymal stem cells

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